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文✎七爷
编辑✎ 七街酒舍
前言
环境中氧气的存在与否是细胞代谢和生理学的重要影响因素。与许多真核生物和一些细菌一样， 枯草芽孢杆菌主要利用呼吸过程中的氧气来产生ATP 。
(资料图)
尽管氧气对枯草芽孢杆菌的生存很重要，但我们对种群如何适应氧气供应的变化知之甚少。
在这里，发现当氧气从固定相枯草芽孢杆菌中耗尽时在培养物中，约90%的细胞死亡，而其余细胞保持集落形成能力。
发现抗菌表面活性素的产生具有两种与氧气相关的健康益处：它通过增加氧气扩散来增加有氧生长产量，并通过使膜去极化在氧气耗尽期间保持活力。 不能产生表面活性素的菌株在缺氧后的生存能力降低了约50倍。
这些细胞的表面活性素处理导致膜去极化并减少ATP产生。改变耗氧量或氧化还原状态的化学和遗传扰动支持一种模型， 在该模型中，表面活性素介导的膜去极化通过减慢耗氧量和/或转变为更降低的代谢特征来维持生存能力。
这些发现强调了膜电位在调节细胞生理学和生长方面的重要性， 并证明当呼吸中的末端电子受体受到限制时，使细胞膜去极化的抗菌剂可以使细胞受益。
这一基础知识对环境微生物学、临床抗菌治疗和工业生物技术具有深远的影响。
缺氧导致大多数枯草芽孢杆菌细胞快速死亡和裂解
在LB中培养B. subtilis菌株3610细胞时，研究注意到当晚指数培养从摇动培养箱转移到工作台上的固定架时， 试管的不透明度在10小时内持续下降，这表明细胞正在死亡和裂解。
与裂解一致，对留在工作台上10小时的培养物进行显微镜观察，发现除了暗相棒状细胞外，还有大量的灰相细胞残余物。
研究得出结论，B. subtilis菌株3610培养物在停止快速生长后的静态孵育期间死亡和裂解。
细胞壁自溶酶是缺氧时裂解非活细胞所必需的
在氧气耗尽时失去活力的细胞也裂解并从完整细胞群中移除，如OD的显著降低所示。
鉴于细胞完整性依赖于坚固的细胞壁，假设裂解涉及细胞壁自溶酶。 细胞壁的生长需要新物质的插入和自溶素对现有肽聚糖的裂解。
在B. subtilis中， 主要的自溶素LytC受营养sigma因子σ A和替代sigma因子σ D ，防止插入中断时细胞壁不受控制的破裂 。研究测量了Δ lytC突变体的OD，发现氧气耗尽后裂解减少。
作为特异性对照，删除另一个σD依赖性自溶素LytD表型复制野生型行为，表明LytC是在缺氧条件下激活的主要自溶素。 尽管耗氧后Δ lytC培养物中的完整生物量水平较高，但与野生型培养物中相似比例的细胞 (~10%) 保留了活力。
缺氧培养物的单细胞成像显示相暗细胞和相灰色“幽灵”的混合种群，均为杆状。 延时显微镜显示只有一部分暗相Δ lytC细胞能够恢复生长 ，这与我们的电镀效率数据一致。
这些数据表明裂解和细胞活力是遗传上可分离的表型，因为许多Δ lytC细胞保持完整但仍失去活力。 因此，氧气耗尽后的活力损失与细胞壁降解无关。
尽管氧气耗尽时裂解减少，但实验室驯化的枯草芽孢杆菌表现出更多的活力损失
B. subtilis实验室菌株168是生物膜形成菌株3610的遗传衍生物，通常用于实验室，因为它被选择用于液体培养的分散生长和改进的遗传易处理性。
在微量滴定板测定中，研究发现在氧气耗尽后，菌株168培养物的OD 600以较低的速率下降，并在整个48小时的监测中保持在较高水平。
缺氧菌株168培养物的成像显示，除了棒状细胞外，还存在圆形细胞。 一些圆形细胞完好无损，未被碘化丙啶染色，而其他圆形细胞被碘化丙啶染色很亮，表明细胞膜受损。
在首先用荧光D-氨基酸(FDAA)染色以标记细胞壁的细胞培养物中，绝大多数圆形细胞没有保留FDAA 染色， 表明它们是没有细胞壁的原生质体。
事实上，菌株168Δ lytC突变体没有形成圆形细胞并且表现出较少的裂解， 表明菌株168中释放的原生质体比它们的壁对应物更脆弱。
因此，得出结论，LytC在氧气耗尽期间降解实验室菌株168中的细胞壁，释放膜结合的原生质体， 这导致菌株168培养物与生物膜形成菌株3610培养物相比具有更高的OD 600 。
Surfactin 通过增加氧扩散提高菌株 168 的生长产量
菌株3610和168有氧生长之间的一个有趣区别是生长曲线在OD 600∼0.3 附近的差异；之后， 菌株3610培养物完成另一次~1.5次质量倍增以达到OD 600~0.9，而菌株168培养物进行1次质量倍增以达到OD 600~0.6。
研究注意到，表面活性素补充剂将菌株168的生长产量增加到与菌株3610相似的水平，尽管由于表面活性素的添加导致最大生长速率略有降低。
当恰好在生长曲线出现分歧之前添加表面活性素时，产量同样得到恢复。 因此，可以得出结论，表面活性素的产生导致菌株3610相对于菌株168的产量增加。
洗涤剂吐温80同样增加了菌株168的产量，表明表面活性素的洗涤剂特性可能是增加菌株产量 的 原因屈服。
转座子筛选支持表面活性蛋白的产生作为缺氧时生存的主要决定因素
考虑到氧气耗尽24小时后生存能力大幅下降，研究进行了基因筛选，以尝试识别可提高菌株 168和3610在无氧条件下存活率的突变。
研究制作了20-30个独立的转座子文库，每个文库在每个背景中有5000-10000个单独的转座子突变体， 并将这些文库置于缺氧状态，假设任何具有增强存活率的突变体都会得到富集。
研究到无法在菌株168中识别出任何此类突变体，这表明在不依赖表面活性素的途径中没有容易获得的功能丧失突变体，该途径会在缺氧时增加生存能力。
在菌株3610中，研究发现了几个突变体，它们在氧气耗尽时裂解减少。 在缺氧48小时后，与这些突变体对应的基因的框内缺失在分离时的存活率低于亲本，这与菌株168和3610之间的差异一致。
许多这些突变体都存在于与表面活性素产生相关的基因中，表明合并文库中其他细胞产生的表面活性素提高了它们的生存能力。 在添加外源表面活性素后，所有突变体都以增加裂解和去除原生质体/细胞碎片作为响应。
事实上，在菌株168中没有获得存活力增加的命中，而菌株3610中的所有命中都对表面活性素有反应并且在隔离点中没有增加适应性，这 表明表面活性素是缺氧情况下存活力的主要决定因素。
Surfactin 通过使膜去极化来恢复活力
Surfactin在体外脂质双层中产生钾离子可渗透孔，并已被建议在枯草芽孢杆菌中引起体内钾渗漏。 这些孔会降低跨膜的钾离子梯度并改变膜电位。
因此，在测定缓冲液中有氧地使用膜电位敏感染料DiSC3和ThT测试了化学处理后的细胞能量状态。 DiSC 3被细胞吸收，荧光被淬灭。使细胞去极化的药物将DiSC3释放到培养基中，导致信号增强。
相比之下，阳离子染料ThT进入具有极化膜的细胞并且荧光增加；去极化后，ThT离开细胞，荧光减弱 。
正如预期的那样，研究发现用缬氨霉素处理168株细胞，这是一种已知的去极化剂，可作为钾特异性转运蛋白发挥作用， 导致DiSC3增加和ThT信号减少。
CCCP，一种耗散质子动力的质子离子载体，强烈降低ThT信号并略微增加DiSC3荧光。 与缬氨霉素相比，Surfactin处理导致DiSC3荧光的大幅增加和ThT荧光的更大降低，表明surfactin可以强烈去极化枯草芽孢杆菌细胞。
去极化可能通过减少耗氧量引起的整体代谢变化来调节生存能力拯救
为了测试surfactin是否通过转录或翻译的产物保持活力，将利福平 （以阻断 RNA 合成） 或氯霉素 （以阻断蛋白质合成） 添加到经surfactin处理的菌株168细胞中。 两种抗生素均未降低存活率。
此外，研究惊奇地发现，在缺乏表面活性素的情况下，用任一药物处理菌株168可显着恢复缺氧期间的活力。
由于这两种药物都不影响膜电位，这些结果表明表面活性素正在介导全球代谢变化，而不是需要转录或翻译的途径特异性适应。
结论
枯草芽孢杆菌细胞在耗氧期间的细胞壁破裂进一步支持了最近发现的膜电位在细胞壁合成中的调节作用 。
事实上，LytC在叠氮化钠处理后被激活，使细胞壁去质子化，大肠杆菌中肽聚糖合成酶的活性受pH调节。
此外，最近的观察表明，枯草芽孢杆菌培养物中活跃生长和休眠的细胞对电脉冲的反应相反，分别是 超极化或去极化 ， 表明膜能量学可以解释对缺氧3610培养物中种群异质性的观察，其中约 90%的细胞死亡，约10%的细胞仍然存活。
因此，由于膜电位在新陈代谢和细胞生长中至关重要，在调节细胞壁重塑方面越来越受到重视，并且可能反馈到细胞生理学的许多其他方面， 细菌必须采用策略来维持和/或调节膜电位在不断变化的环境条件下。
此外，膜电位可能是其他细胞命运异质性实例的关键组成部分，例如噬菌体感染期间的裂解/溶原性决定。 B. 枯草芽孢杆菌在空间结构复杂的环境中，如原生土壤群落，以及调节膜电位的策略也可能是其他严格需氧菌生存的重要因素。
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